如何評價SEM圖片的質(zhì)量？這是一個頗為復雜的問題，涉及到主觀因素。SEM圖的解讀需要觀察者根據(jù)自己的經(jīng)驗和知識進行分析和判斷，其中觀察者的主觀偏見或期望可能會影響對圖像的解讀，比如刻意避開不理想的區(qū)域，選擇局部OK區(qū)域來代表自己的預期。

     如果忽略主觀因素，那怎么才算一張高質(zhì)量的SEM照片呢？

     從視覺感受出發(fā)：1.要具備高分辨能力，能夠清晰地顯示樣品的細節(jié)和顯微結(jié)構(gòu)，邊界銳利，不模糊。2.襯度適中，突出樣品的特征，使不同部分易于區(qū)分。3.低噪聲，具有足夠的信噪比，實現(xiàn)圖像細節(jié)的高清度（注意，這個和分辨率還不是一個概念，可以理解為單位像素點上束流密度變大了）。4.無失真，尤其是在低倍數(shù)下，保持樣品的原始形狀和比例，避免圖像扭曲或變形，有助于進行準確的測量和分析。5.足夠的景深，對于具有層次感的樣品，譬如多孔材料或金屬斷口，需要使整個樣品都能清晰成像，而不僅僅是表面。6. 要有代表性，能夠準確地代表樣品的整體特征，不是局部或異常的表現(xiàn)，這對于得出可靠的結(jié)論和進行比較研究很關鍵。7.準確的標注：包括哪種放大倍數(shù)，工作距離，探測器等必要的標注，使其他人能夠理解圖像的相關參數(shù)信息，有助于圖像的交流和引用。8.符合研究目的：能夠滿足研究或分析的特定需求，與研究問題或目標相關，能為研究提供有價值的信息和證據(jù)。

圖1 陶瓷過濾膜截面。低加速電壓不鍍金成像，可辨別支撐體上不同孔尺寸的3層過濾膜，膜層顆粒堆積的形態(tài)以及顆粒表面細節(jié)。圖注：著陸電壓500V，減速電壓2KV，束流25pA,賽默飛Apreo2T1探測器。

圖2 陶瓷過濾膜截面。低加速電壓不鍍金成像，可清楚的辨別支撐體上不同孔尺寸的2層氧化鋯過濾膜，膜層顆粒堆積的形態(tài)。圖注：5KV，束流50pA,賽默飛Apreo2 T1 探測器。

      有了以上SEM照片質(zhì)量的評價標準，那么，對于電鏡操作員來說，如何獲得高質(zhì)量的圖片呢？

這也是一個比較復雜的問題，細分來說，可以從以下幾個角度考慮：1.樣品制備，2選擇合適的儀器參數(shù)，比如加速電壓，工作距離，束流大小等，3.聚焦和合軸，4.選擇合適的探測器，5.選擇合適的掃描速度，6圖像的后期優(yōu)化處理。

總的來說，需要通過實踐和經(jīng)驗積累，掌握如何調(diào)整參數(shù)和優(yōu)化成像條件。同時注意觀察圖像中的細節(jié)和異常，及時調(diào)整參數(shù)以獲得更好的結(jié)果。另外，作為初學者，需要與有經(jīng)驗的SEM操作人員、研究人員或工程師交流，從他們那里獲得經(jīng)驗和技巧。也可以積極參加培訓課程或研討會，提高自己的技能水平。

      要獲取高質(zhì)量的圖片，樣品制備至關重要。處理不當?shù)臉悠窌е掠^察假象，對于大多數(shù)樣品的要求是，應干燥且導電，以獲得效果。

首先因為觀察的對象不同，有生物樣品，也有材料樣品，因此，并非所有SEM都使用相同的樣品制備順序。此外，SEM的具體步驟取也決于具體的設備類型，以下是一些常規(guī)的流程和注意事項，旨在簡單闡述制備樣品的過程。

圖3 SEM樣品制備的流程：干燥樣品和含水樣品。

      SEM中生物樣品的制備步驟一般包括：1取材：選擇合適的生物樣本；2清洗：去除表面的雜質(zhì)；3固定：使用化學試劑固定樣本；4脫水：通過梯度脫水處理；5干燥：選擇適當?shù)母稍锓椒ǎ?鍍膜：通常使用金、鉑等金屬進行鍍膜，增加導電性；7.觀察：將制備好的樣品放入SEM中進行觀察。

在整個制備過程中，需要注意以下幾點：盡量保持樣本的原始結(jié)構(gòu)和形態(tài)。控制每個步驟的條件，以確保樣品的質(zhì)量。避免污染和損傷樣品。

1.1 生物樣品：固定

      含水樣品主要涉及到生物類樣品，生物樣品通常具有高含水量。如果樣品未經(jīng)特殊處理就放入SEM真空中，由于真空會將水從樣品中抽出，樣品結(jié)構(gòu)可能會受到嚴重損壞，同時也會污染SEM樣品倉。對于這類樣品，簡單的風干或加熱干燥方法并不合適，因為在干燥過程中樣品會發(fā)生變化(想想生活中，葡萄和葡萄干之間的區(qū)別)。

圖4 葡萄與葡萄干，結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變

     生物樣品的制備步驟通常通常需要復雜且周期長，包括固定、脫水和干燥。一旦樣品干燥，就可以將其安裝在SEM樣品上，然后鍍膜或者不鍍膜觀察。

生物樣品的制備流程主要涉及以下步驟：

     化學固定（Chemical fixation）：化學固定法是將樣品浸入化學固定液中。通常使用的是含3%戊二醛在0.1M 緩沖溶液（如Sorrenson磷酸鹽緩沖溶液），PH值取決于組織，植物組織通常使用6.8，動物組織通常使用 7.2-7.4。磷酸鹽緩沖液無毒，戊二醛可交聯(lián)蛋白質(zhì)，使樣品更堅硬。

組織一般在固定液中浸泡1-2小時（取決于樣品大?。瑴囟葹?℃，有時也可在室溫下浸泡。然而，用于SEM的樣品可在固定液中存放數(shù)周而不會明顯降解。使用帶有散熱片的 BioWave 微波爐可加快固定過程。

       一次固定后通常會用緩沖液清洗，然后進行第二次化學固定，以穩(wěn)定部分脂質(zhì)成分（脂肪酸）。在室溫下（在通風櫥內(nèi)?。?，將1%的溶于緩沖液（如 0.1M 的可可堿緩沖液）中1到2小時。

對于只關注外部結(jié)構(gòu)的SEM來說，較大的組織塊通常不需要長時間固定，因為內(nèi)部固定不佳并不那么重要。固定后，樣品需要在乙醇中逐級脫水，然后通過臨界點干燥（CPD）或冷凍方法干燥。

     備注：在 SEM 生物樣品制備的梯度脫水過程中，常用的乙醇或丙酮濃度依次為：30%乙醇或丙酮：浸泡一段時間。50%乙醇或丙酮：再浸泡一段時間。70%乙醇或丙酮：繼續(xù)浸泡。90%乙醇或丙酮：浸泡一定時間。100%乙醇或丙酮：脫水。

具體的濃度參數(shù)可能因生物樣品的類型、大小和特性而有所不同。

      蒸汽固定（Vapour fixation）：不是所有的樣品都適合化學固定，有些樣品就很容易損壞，因此不可能浸入液體中。這對于真菌及其子實體(分生孢子)來說尤其如此，它們在接觸時會從母體植物中分離出來。

蒸汽固定使用一滴固定劑，放在密封容器中靠近樣品的地方。在切下的受感染的葉片材料的情況下，用4%的水溶液，在大約1小時內(nèi)固定樣品。樣品固定后會變黑，這有助于評估進度。一旦固定，樣品可以放在用液氮冷卻的金屬塊上冷凍，然后冷凍干燥。

     冷凍固定（Cryofixation）：快速冷凍含有液體或水的樣品會使液體變成固體，而不會形成很多晶體。有許多冷凍樣品的裝置。高壓冷凍的技術，可以產(chǎn)生的形態(tài)，但是它們需要極小的樣品量（非常適用于TEM）。對于SEM來說，將樣品放入液氮流體或液氮泥漿中通常就足夠了，或者可以將在SEM樣品倉中通過冷臺來冷凍樣品。

一旦冷凍，樣品就可以很容易地觀察樣品的原始形貌，這也可以避免切割軟材料造成的損壞。通常需要在冷凍樣品上鍍上一層金屬觀察。冷凍樣品可以在冷凍狀態(tài)下保存很長時間，這個流程涉及到的安全問題包括凍傷和氮氣窒息。

1.1 生物樣品：干燥

      冷凍干燥（freeze drying）：冷凍干燥通過蒸發(fā)除去樣品中的冷凍水，也就是說，水分子沒有先轉(zhuǎn)化為水就從冰中消失了，這個過程很慢，但如果做得好，通常可以讓樣品保持完好和干燥。優(yōu)點是避免了危險的化學固定劑。

樣品一般放在大型預冷金屬塊的凹陷處，一旦進入冷凍干燥室，就打開真空，讓機器在零下30度左右運行3天左右。

需要注意的是，因為干燥后樣品的重量比比較輕，所以在干燥過程結(jié)束時，必須小心將空氣引入室內(nèi)，否則樣品會被風吹走而丟失。

     臨界點干燥（Critical point drying，CPD）：樣品中的水逐漸被乙醇取代，乙醇隨后被液態(tài)二氧化碳取代。然后增加容器的壓力和溫度，直到CO2達到臨界點，從液相變成氣相。這樣可以避免風干過程中造成的損壞，從而保護樣品結(jié)構(gòu)。

     化學干燥（Chemical-drying）：CPD的替代方法是使用六甲基二硅烷或HMDS，沒有水的擠壓表面張力，甚至沒有乙醇蒸發(fā)造成的損害。

溶劑(優(yōu)選乙醇)中的樣品可以作為50:50的溶液引入HMDS，然后變成100% HMDS (2次變化)。更換時，可以將溶液排干，直到剛好蓋住樣品，然后放在通風柜中蒸發(fā)。對于非常小的樣品，這可能需要幾分鐘的時間，對于較大的樣品，這可能需要幾天的時間。

對于不適合CPD室的大樣品，或者載玻片/硅片上的樣品，這是CPD的有用替代方法。然而，并非所有來自HMDS的樣品都能成功干燥。此外，為了安全起見，不要吸入HMDS蒸汽，也不要將任何混有乙醇的溶液儲存在封閉的瓶中，因為蒸汽壓力會增加并導致爆炸。

此外，高分子聚合物樣品可以是濕的，也可以是干的。如果它們是濕的(或含有大量的水或液體),則需要在SEM檢測之前進行干燥。高分子聚合物材料通常不需要進行固定，但必須清除其中的液體。凝膠類多孔高分子聚合物樣品，通常采用冷凍干燥，一旦樣品干燥，就可以將其安裝在樣品臺上，然后鍍膜或不鍍膜觀察。

1.2 材料樣品的表面觀察

圖5 不同材料的樣品制備方法：觀察表面

1.3 材料樣品的截面觀察

圖6 不同材料的斷面制備方法：觀察斷面

     我們關注材料的信息，通常是關注樣品的表面或內(nèi)部細節(jié)，因此以上也針對不同材料的表面和斷面制備進行了簡單的總結(jié)，這里就不再對各工藝細節(jié)進行詳細的闡述。后續(xù)也會有專題對樣品制備進行就行詳盡的討論。

制備好的SEM樣品附著在樣品臺上，這也是制備樣品的一個非常重要的部分。因為SEM是一種表面成像技術，感興趣的樣品部分必須朝上，對于塊狀樣品，樣品表面和樣品臺底座之間必須有連續(xù)的通路（通常會用導電膠或?qū)щ姖{料架起導電橋梁，再鍍導電膜），這樣電荷就不會積聚。

圖7  盡量讓塊體或大顆粒粉末狀樣品跟金屬襯底保持導電通路

     要使用SEM，必須首先將樣品放入樣品室。由于樣品室保持真空，必須將干燥的空氣或氮氣引入樣品室，以便打開樣品室并將樣品放在載物臺上。盡量不要讓樣品倉門開太久，如果腔室沒有保持在真空下，抽氣時間會增加，并且長期這樣操作，污染會在腔室內(nèi)慢慢積聚。

      為什么要調(diào)整儀器參數(shù)？首先，優(yōu)化圖像質(zhì)量，通過調(diào)整參數(shù)，可以獲得更清晰、更詳細的圖像。其次，適應樣本特性，不同的樣本可能需要不同的參數(shù)設置。第三，提高分辨率，以更好地分辨樣本的微觀結(jié)構(gòu)。第四，控制電子束強度，避免對樣本造成過度損傷。第五，調(diào)整襯度，增強圖像的襯度，便于觀察。第六，優(yōu)化景深使整個樣本都能清晰成像。第七，適應不同的放大倍數(shù)，確保在不同放大倍數(shù)下都能獲得良好的圖像。

2.1 加速電壓

      理論上，加速電壓的增加將使SEM圖像中的信號更多、噪聲更低。但實際情況并非如此簡單。高加速電壓成像有一些缺點: 1. 高加速電壓可穿透較厚的樣品，但在SE模式下，對樣品表面結(jié)構(gòu)細節(jié)的分辨能力降低，低加速電壓則適用于表面成像；2絕緣樣品中的電子堆積增加，造成更嚴重的充電效應；3 在樣品中傳導的熱量會增加，可能導致樣品損傷，尤其是對熱敏感的材料。

      加速電壓越高，電子束穿透力越強，相互作用體積越大，背散射電子（BSE）的數(shù)量也會增加。對于典型電壓（如15KV）下的二次電子（SE）成像，BSE會進入二次電子探測器，并降低分辨率，因為它們來自樣品的更深處。

圖8 不同加速電壓下，電子束與樣品的相互作用體積不一樣，高加速電壓穿透的更深

    加速電壓是燈絲和陽極之間的電壓差，主要用于加速電子束向陽極移動。典型SEM的加速電壓范圍為1KV至30KV。電壓越高，電子束穿透樣品的能力就越強。

圖9 不同加速電壓帶來的成像效果差異。1KV加速電壓下，呈現(xiàn)更多的表面細節(jié)。賽默飛Apreo2 T1 探測器。

    下表中提供了選擇加速電壓的一般操作指南。當然，不同的電鏡設備，即使參數(shù)相同，成像效果也會有差異，要確定樣品成像的設置，需要進行實踐操作。

圖10 加速電壓選擇的一般操作指南。對于電子束敏感材料以及需要觀察樣品極表面細節(jié)的樣品，通常需要更低的電壓和更低的束流。

2.2 光闌

      光闌是金屬條上的一個小孔，它被放置在電子束的路徑上，以限制電子沿鏡筒向下運動。光闌可阻止偏離軸線或能量不足的電子沿柱子向下運動。根據(jù)所選光闌的大小，它還可以縮小光闌下方的電子束。

圖11 物鏡光闌對電子束路徑的影響示意圖

物鏡 (OL) 光闌：該光闌用于減少或排除外來（散射）電子。操作員應選擇的光闌，以獲得高分辨率的SE圖像。

   物鏡光闌安裝在SEM物鏡的上方，是一根金屬桿，用于固定一塊含有四個孔的金屬薄板。在它上面裝有一個更薄的矩形金屬板，上面有不同大小的孔（光闌）。通過前后移動機械臂，可以將不同大小的孔放入光束路徑中。這都限于老式掃描電鏡，現(xiàn)代電鏡通過靜電偏轉(zhuǎn)到想要的孔，不是機械移動。

圖12 機械臂上有一個細金屬條，上面有不同大小的孔，這些孔與較大的孔對齊，該金屬條被稱為光闌條?？字睆綇?0微米到1000微米不等

      大光闌可用于低倍成像以增加信號，也可用BSE成像和EDS分析工作。小光闌用于高分辨率工作和更好的景深，但缺點是到達樣品的電子較少，因此圖像亮度和信噪比較低。

       下表列出了一些光闌大小和實際用途的例子。不同光闌可使用數(shù)字刻度。例如，可以使用1、2、3和4。根據(jù)儀器的不同，可以用的數(shù)字表示的光闌直徑，也可以用的數(shù)字表示小的光闌。

       在SEM設備校準過程中，為了生成良好的圖像，需要檢查光闌，以確保其圍繞光束軸居中，這可以通過使用晃動（Wobbler）控制來實現(xiàn)。如果發(fā)現(xiàn)圖像左右移動，則需要在 X 或 Y方向（進出或左右移動）調(diào)整光闌，調(diào)整時只需微微旋轉(zhuǎn)相應的旋鈕，直到圖像停止移動為止。當電子束直徑在樣品表面達到小值時，聚焦效果好。圖像應清晰明確。

2.3 束斑尺寸

       電子束錐在樣品表面形成的束斑大?。M截面直徑）會影響：1）圖像的分辨率；2）產(chǎn)生的電子數(shù)量，從而影響圖像的信噪比和清晰度。在低倍放大時，我們使用的束斑尺寸要比高倍放大時大。

圖13 不同束斑大小對圖像分辨率的影響

       當在相同的放大倍率、電壓和工作距離下使用不同的束斑尺寸拍攝圖像時，很容易看出不同系列圖像在模糊度（分辨率）上的差異。表達束斑大小的方式取決于所用電鏡的廠家和型號。

      下圖是在三種不同束斑尺寸下拍攝的硅藻。在束斑尺寸（束斑5）下，圖像顯示的細節(jié)少于小束斑尺寸（束斑1）。不過，在小束斑尺寸下，圖像的信噪比有所降低。

圖14 三種不同束斑尺寸下拍攝的硅藻

   對于任何一個放大倍率，停留點（圖中一行中的光點）的數(shù)量都是恒定的，因此束斑點尺寸太小會導致沒有信號產(chǎn)生的間隙，束斑尺寸太大會導致信號重疊和平均。

      束斑尺寸會隨著一些參數(shù)的改變而改變。例如，長工作距離（WD）下的束斑尺寸比短WD的大。物鏡光闌越小，束斑尺寸越小。此外，無論使用哪種 WD，聚光透鏡流過的電流越大（激勵強，聚焦效果好），樣品上的束斑就越小。

因此，當WD較小、聚光透鏡激勵較高、光闌較小時，我們就能實現(xiàn)小的束斑尺寸。這三個參數(shù)是相互影響的，需要仔細權(quán)衡，才能獲得圖像，因為它們還會影響其他參數(shù)，如焦距和電子信號強度。

2.4 工作距離（WD）：分辨率與景深

        樣品工作距離 (WD) 是指SEM鏡筒極靴底部與樣品頂部之間的距離。在樣品室中，樣品臺可以上升到更靠近極靴的一端（工作距離短），也可以下降到更低的位置（工作距離長）。

圖15 工作距離（WD）示意圖

      工作距離越短，樣品表面的電子束直徑就越小。因此，在可能的情況下，工作距離應保持在10毫米或更小，以獲得高分辨率成像。但小工作距離的缺點是，會大大降低景深。雖然可以通過使用較小的物鏡光闌來抵消這種不利因素，但同時也帶來電子束流密度的降低（圖像看起來顆粒感更強，不夠細膩）。

備注：對于ET探測器來說，縮短WD帶來高分辨率的效果是不夠顯著的。對于大部分鏡筒內(nèi)電子探測器，縮短WD能顯著提高分辨率。這也是我們經(jīng)常看到，高倍數(shù)的照片都是在短WD下拍攝的，情況下，WD可以＜1mm。

       在許多 SEM 中，外部工作距離 (Z) 控制桿可用于升高或降低試樣，該值通常被誤認為是準確的工作距離。然而，真正的工作距離 (WD)是以電子方式測量的，即樣品表面聚焦點到極靴下表面的距離。外部Z控制（機械控制）值與圖像屏幕上提供的 WD 值不同有三個原因。

只有當電子束準確聚焦到試樣表面時，"屏幕上"的 WD 值才是準確的測量值。聚焦不足或聚焦過度的圖像會提供虛假的WD值以及模糊的圖像。

外部Z值和準確聚焦試樣的真實 WD 值會有所不同，因為這兩個測量值可能是從試樣架上的不同點測量的。試樣如果不是均勻平整的，不同的形貌特征會有不同的真實WD。

      WD會影響SEM圖像的景深和分辨率。隨著WD的增加，電子束發(fā)散角會減小，從而提供更大的景深。增加WD的"代價"是，電子束必須從掃描移動更遠的距離，因此在試樣上的束斑尺寸更大。

     景深是指試樣在肉眼看來可接受的聚焦垂直范圍。在SEM中，圖像景深的 "范圍 "通常比光學顯微鏡大上百倍，因此許多SEM顯微照片幾乎都是三維的。

圖16 不同工作距離帶來的景深效果不一樣，WD越大，景深越好

2.5 圖像的襯度和亮度

     SEM圖像是根據(jù)從樣品材料中射出的電子數(shù)來構(gòu)建的強度圖（數(shù)字或模擬）。SEM中每個駐留點的電子信號以像素的形式在屏幕上逐行顯示，從而形成圖像。每個點的信號強度反映了從形貌或成分中產(chǎn)生的電子多少。通過信號處理，每個電子的信號信息（從光束的每個駐留點獲得）都可以在顯示之前被轉(zhuǎn)換成與原始值有嚴格關系的新值。這樣，我們就可以通過調(diào)整信號來改變圖像的襯度和亮度。

       在大多數(shù)情況下，未經(jīng)處理的圖像包含足夠的"自然襯度"，操作員可以從圖像中提取有用的信息。自然襯度可被視為直接來自樣品和探測器系統(tǒng)的信號中包含的襯度。如果自然襯度過低或過高，則可能會丟失與重要細節(jié)相對應的信號變化。

       在這種情況下，我們會看到圖像中有很多黑色或白色區(qū)域。質(zhì)量好的圖像具有灰度漸變，只有極少部分是全黑或全白的。信號處理技術可以處理自然襯度，使眼睛可以通過圖像中的襯度感知信息。雖然信號處理技術允許用戶對自然襯度進行處理，但并沒有增加信息，只是增強了已有的信息（因此，這種圖像處理技術不屬于對已有信息的篡改）。

      以下這幅圖像左側(cè)襯度太低，右側(cè)襯度太高，中間的圖像襯度是合適的。左邊的圖像可以后期調(diào)整，方法是在Photoshop軟件中修改灰度 "色階"的分布，但右圖像無法修正，因為是純黑白區(qū)域的（無法從這些區(qū)域獲取更多數(shù)據(jù)）。

圖17 圖像襯度對比

         應該注意的是，信號處理會極大地改變圖像的外觀，使其與通常預期的不同，因此SEM操作員有義務說明是否進行了處理。不過，通常情況下，使用襯度和亮度旋鈕調(diào)整圖像質(zhì)量是被認可的圖像處理流程。但是，如果為了使SEM圖像看起來更清晰而進行了一些其他處理，則應在正式報告中說明具體的處理的方式。

        舊型號的SEM一般都需要手動調(diào)整襯度和亮度。更現(xiàn)代的機器則依靠軟件程序自動調(diào)節(jié)，輔以機器操作員的喜好：一鍵操作，提高工作效率。但需要注意的是，人眼對圖像襯度和亮度的感知或?qū)徝?，往往和軟件計算的結(jié)果并不一致，因為為了更好的圖片質(zhì)感，還需要依賴手動調(diào)節(jié)。

      傾斜樣品可以增加SE襯度：增加SE襯度的另一種方法是傾斜樣品，使其與探頭成一定角度（通常為 30° 至 60°）。傾斜的結(jié)果是，每單位投影試樣面積會產(chǎn)生更多的 SE，從而使亮部和暗部的分布更加明顯，從而增強襯度。

2.6 放大和校準

     放大是指放大圖像或圖像的一部分。在SEM中，放大是通過掃描較小的區(qū)域來實現(xiàn)的。在圖像中，樣品上的電子束用箭頭表示。

    當掃描到一個較小的區(qū)域時，我們看到的是物體變大了。以下的顯微圖像的放大倍數(shù)從 900倍到 10000 倍不等。

圖18 隨著掃描區(qū)域的不同，放大倍數(shù)也會隨之改變

     圖像的放大倍數(shù)通常會在屏幕上給出一個數(shù)值（如2000x）。圖像上還會有一個刻度條，代表精確的距離單位。

      在掃描電鏡中，通常涉及到兩個倍數(shù)，一個是底片倍數(shù)，一個是顯示倍數(shù)。底片倍數(shù)，指掃描電鏡獲取圖像時，實際拍攝到5英寸底片上的放大倍數(shù)。顯示倍數(shù)是指在顯示器上顯示的放大倍數(shù)。初學者搞不清楚底片倍數(shù)和顯示倍數(shù)的區(qū)別，同樣的細節(jié)長度，顯示倍數(shù)通常會比底片倍數(shù)高2-3倍，因此，衡量物體尺寸的大小看標尺刻度，而不是放大倍數(shù)。

     SEM的基本維護包括定期檢查放大倍率的校準。在標準條件下對標準樣品（如光柵網(wǎng)格）進行成像。對圖像上的特征進行測量，并與給定的放大倍率或刻度條進行比較，以確保達到正確的尺寸。如果不正確，可以遵循校準程序。

在標準條件下，屏幕上顯示的放大倍數(shù)可能包含2-5%的誤差。在許多情況下，這種不確定性是可以接受的。但是，如果所做的工作需要很高的精確度（尤其是半導體行業(yè)的精確測量），則必須使用與實驗條件相同的條件和校準標準來校準系統(tǒng)，校準標準的特征應與您希望在實驗中測量的特征的尺寸密切匹配。例如，如果需要測量直徑為 500nm 的顆粒大小，校準樣品應包含相同大小的特征。

2.7 掃描速率和信噪比

       如果需要采集高質(zhì)量的圖像，以供日后使用或出版時，通常會降低掃描速率。較慢的掃描速率可以在電子束掃描線上的每個像素點收集到更多的電子。這樣可以生成質(zhì)量更好的圖像。

      SEM的圖像質(zhì)量受束斑大小和信噪比的限制。信噪比是電子束產(chǎn)生的信號（S）與儀器電子設備在顯示該信號時產(chǎn)生的噪聲（N）之比（S/N）。噪聲脈沖來源于電子束亮度、聚光透鏡設置（束斑尺寸）和 SE 探測器靈敏度，可能會給圖像帶來類似顆粒感。當SEM參數(shù)設置為高分辨率成像時，其信噪比通常較低，因此會出現(xiàn)顆粒感，這可能是不可避免的。隨著每個圖像點記錄的電子總數(shù)的增加，SEM的圖像質(zhì)量和信噪比也會隨之提高。

圖19 左圖隨著信噪比的增加，圖像質(zhì)量也會提高

      鎢（W）燈絲的特點是亮度低，導致成像的電子束流密度低。因此，在聚光透鏡設置為高分辨率成像時（小束斑尺寸），到達試樣的電子數(shù)量較少。因此，SE 產(chǎn)量低，為了生成高質(zhì)量的圖像，必須使用大束流，這就彌補了信噪比的不足，但同時也帶來了分辨率的下降。為了克服 W 燈絲的亮度限制并提高信噪比，人們開發(fā)了場發(fā)射槍 (FEG) 等明亮相干光源。

2.8 圖像的假象：像散/邊緣效應/充電效應/電子束損傷和污染

      要獲得的圖像，需要基礎理論知識和實踐，并且需要在許多因素之間進行權(quán)衡。這個過程可能會遇到一些棘手的問題。

像散

     像散是圖像中難精確校正的調(diào)整之一，需要多加練習。下圖中間的圖像是經(jīng)過像散校正的正確聚焦圖像。左圖和右圖是像散校正不佳的例子，表現(xiàn)為圖像出現(xiàn)拉伸的條紋。

      為實現(xiàn)精確成像，電子束（探針）到達試樣時的橫截面應為圓形。探針的橫截面可能會扭曲，形成橢圓形。這是由一系列因素造成的，如加工精度和磁極片的材料、鐵磁體鑄造中的缺陷或銅繞組。這種變形稱為像散，會導致聚焦困難。

    嚴重的像散可表現(xiàn)為圖像中X方向的"條紋"，當圖像從對焦不足到對焦過度時，條紋會轉(zhuǎn)變?yōu)?Y 方向。在精確對焦時，條紋會消失，如果束斑大小合適，就能正確對焦。

圖20 像散示意圖，消除像散的圖片如中間所示

      為了使探針呈圓形，需要使用像散校正器。這包括以四邊形、六邊形或八邊形方向放置在鏡筒周圍的電磁線圈。這些線圈可以調(diào)整電子束的形狀，并可用于校正任何重大的透鏡變形。

     在放大 10,000 倍左右的情況下，將物鏡調(diào)整到欠焦或過焦時，如果圖像在一個方向或另一個方向上沒有條紋，則一般認為圖像沒有像散。在1000倍以下的圖像中，像散通?？梢院雎圆挥?/strong>。

     校正像散的方法是將X和Y像散器設置為零偏移（即不進行像散校正），然后盡可能精細地對焦樣品。然后調(diào)整X 或Y消像散器控制（不能同時調(diào)整）以獲得圖像，并重新對焦。

邊緣效應

   邊緣效應是由于試樣邊緣的電子發(fā)射增強所致。邊緣效應是由于形貌對二次電子產(chǎn)生的影響造成的，也是二次電子探測器產(chǎn)生圖像輪廓的原因。電子優(yōu)先流向邊緣和峰頂，并從邊緣和峰頂發(fā)射，被探測器遮擋的區(qū)域，如凹陷處，信號強度較低。樣品朝向探測器區(qū)域發(fā)射的背向散射電子也會增強形貌襯度。降低加速電壓可以減少邊緣效應。

圖21 邊緣效應產(chǎn)生示意圖

       電子在樣品中聚集并不受控制地放電會產(chǎn)生充電現(xiàn)象，這會產(chǎn)生不必要的假象，尤其是在二次電子圖像中。當入射電子數(shù)大于從樣品中逸出的電子數(shù)時，電子束擊中樣品的位置就會產(chǎn)生負電荷。這種現(xiàn)象被稱為"充電Charging"，會導致一系列異常效果，如襯度異常、圖像變形和偏移。有時，帶電區(qū)域的電子突然放電會導致屏幕上出現(xiàn)明亮的閃光，這樣就無法捕捉到襯度均勻的樣品圖像，甚至會導致小樣品從樣品臺上脫落。

        充電效應的程度與 (1) 電子的能量和 (2) 電子的數(shù)量有關。電子的能量與加速電壓有關，因此降低加速電壓可以減少充電。電子的數(shù)量與許多參數(shù)有關，包括束流、電子槍的種類、束斑大小以及電子槍和試樣之間的光闌。因此，通過調(diào)整這些參數(shù)來減少電子數(shù)也可以減少充電效應。

圖22 橫向的亮暗帶是充電的結(jié)果

      要解決不導電樣品的充電問題，在樣品制備方法上是在樣品上鍍上一層較厚的金或鉑薄膜，這樣做是為了提高表面的導電性，使足夠的電子能夠逸出，避免表面充電和損壞。顆粒等松散材料經(jīng)常會受到充電的影響，在實際操作上，這些樣品都通過磁控濺射鍍膜儀來鍍上一層厚3-10nm的金屬層。

圖23 鋰電池干法隔膜。上圖，不鍍膜，即使在500V低電壓下，T2探測器成像存在明顯的充電效應，隔膜形態(tài)無法辨別。下圖，鍍膜后，可以很好的緩解充電效應，用T2能拍清楚隔膜表面細節(jié)輪廓和孔隙的大小，插圖為AFM圖，可以證實，濺射的過程并沒有對隔膜造成損傷，保持了較真實的結(jié)構(gòu)細節(jié)。

圖24 鋰電池隔膜。除了鍍膜處理，采用Apreo2的T1探測器可以直接對隔膜成像，相比鍍膜后的效果，表面細節(jié)可以辨別，但還不夠清晰。

      此外，在相同的電鏡參數(shù)條件下，比如都是低加速電壓成像，合理的選擇探測器，也有助于緩解荷電效應。從上面的隔膜樣品就能看出來，同樣的參數(shù)T2和T1探測器，對充電效應的敏感程度是不一樣的。

圖25 樹脂溶液中的橡膠納米粒子，不鍍金。即使選擇Apreo2電鏡的T2探測器在1KV下成像，但依舊存在充電效應。切換到T1探測器，不僅能避免充電效應，還能準確測量出溶液中的納米顆粒尺寸。

         此外，除了低加速電壓成像，具有低真空功能的SEM或環(huán)境SEM (ESEM) 可用于控制充電效應。

用電子束輻照試樣會導致電子束能量以熱量的形式流失到試樣中。較高的加速電壓會導致輻照點的溫度升高，這可能會損壞（如熔化）聚合物或蛋白質(zhì)等易碎試樣，并蒸發(fā)蠟或其他試樣成分，同時也會污染鏡筒。

       解決辦法是降低電子束能量，增加工作距離也有幫助，因為在相同的電子束能量下，可以在樣品上產(chǎn)生更大的束斑，但這樣做的缺點是會降低分辨率。

與電子束相關的污染是指在電子束掃描過的樣品區(qū)域沉積材料（如碳），這是電子束與真空室中的氣態(tài)分子（如碳氫化合物）相互作用的結(jié)果。

      解決這種假象的方法之一是先用低倍放大鏡拍攝顯微照片，然后再用高倍放大鏡拍攝。在將樣品放入SEM腔室之前，確保樣品盡可能干凈，或者采用等離子清洗樣品，也可以減少這種假象。對于場發(fā)射電鏡而言，在處理樣品時通常需要戴上手套，以防止被手指油脂等污染。

圖26 采用等離子清洗，消除樣品表面污染和假象

      總之，獲得滿意的SEM圖片需要綜合考慮樣品制備、儀器設置和圖像處理等方面的因素。在樣品制備過程中，需要選擇合適的樣品、清洗方法和干燥方法。在儀器參數(shù)設置過程中，需要選擇合適的加速電壓、工作距離和探測器類型等。在圖像處理過程中，需要選擇合適的圖像增強、信號過濾方法。此外，還要考慮像散/邊緣效應/充電效應/電子束損傷和污染的因素。

通過綜合考慮并權(quán)衡這些因素，可以獲得高質(zhì)量的SEM圖像，從而提高對材料的分析和理解水平。